氯霉素是一種對(duì)革蘭氏陰性菌以及陽(yáng)性菌都 有很好抑制作用的抗生素，曾經(jīng)對(duì)畜禽疾病的控 制和治療起到了特別重要的作用。由于氯霉素藥 性比較穩(wěn)定而且價(jià)格比較便宜，在養(yǎng)蜂業(yè)中經(jīng)常 會(huì)使用氯霉素，用于防止蜜蜂爬蜂病，因此蜂蜜 中可能含有氯霉素殘留。如果大量食用含有氯霉 素殘留的食物會(huì)使人產(chǎn)生耐藥菌株，而且會(huì)破壞 人體內(nèi)正常菌群的平衡狀態(tài)。氯霉素存在嚴(yán)重的 副作用，能引起人的再生障礙性貧血、粒細(xì)胞缺 乏癥等疾病。因此，美國(guó)規(guī)定在動(dòng)物性食品中不 得檢出氯霉素，歐共體不允許氯霉素用于產(chǎn)奶母 牛和產(chǎn)蛋雞。歐盟已明文規(guī)定了氯霉素等多種抗 生素藥物不再作為獸藥使用。國(guó)外對(duì)進(jìn)口蜂蜜中 氯霉素的殘留限量定在0.1 µg/kg。

抗生素殘留檢測(cè)方法目前主要有微生物法、 理化檢測(cè)法、免疫分析法。微生物法存在 操作時(shí)間長(zhǎng)、結(jié)果偏差大等缺點(diǎn)，很難定量檢 測(cè)。理化檢測(cè)法需要昂貴的檢測(cè)儀器及專業(yè)的操 作技能，結(jié)果準(zhǔn)確，常作為最終確證的方法。色 譜或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是目前比較成熟而且可以 投入到實(shí)際操作的抗生素檢測(cè)技術(shù)，優(yōu)點(diǎn)是靈敏 度較高、分辨率高，可進(jìn)行定性和定量分析，同 時(shí)可檢測(cè)多個(gè)抗生素種類，但是由于前處理步驟 較多，費(fèi)時(shí)，而且需要大型儀器設(shè)備，所以很難 在一些小型的食品檢測(cè)企業(yè)或農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行推廣，僅 僅適用于檢驗(yàn)檢疫部門用來(lái)作為終判的方法。因 此，更加簡(jiǎn)單快速、低成本的分析檢測(cè)方法需要 被開(kāi)發(fā)出來(lái)以滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。免疫分析法 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、通量性高 等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為初篩的首選方法。免疫分析 法的基本原理是抗原或半抗原和抗體發(fā)生特異性 的免疫反應(yīng)，常用的方法包括試紙條法和酶聯(lián)免 疫吸附法。試紙條法簡(jiǎn)單快速，酶聯(lián)免疫吸附法 可以定量，但一次只能檢測(cè)一個(gè)指標(biāo)。

蛋白質(zhì)芯片方法又稱蛋白質(zhì)微陣列，是在基 因芯片之后發(fā)展起來(lái)的一種分析方法。其原理是 對(duì)固相載體進(jìn)行特殊的化學(xué)處理，再將已知的大 量蛋白(如酶、抗體、抗原、細(xì)胞因子等)有規(guī)律 地固定在上面，根據(jù)這些大分子蛋白的特點(diǎn)，捕 獲能與之特異性結(jié)合的待測(cè)蛋白(存在于血清、血 漿、淋巴、組織液等)，然后用芯片分析儀進(jìn)行掃 描，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)芯片方法在動(dòng)物源 性食品抗生素殘留的檢測(cè)方面應(yīng)用很廣泛。 蛋白芯片方法是一種高通量的檢測(cè)方法，能在一 次實(shí)驗(yàn)中提供大量的信息。靈敏度高，可以準(zhǔn)確 檢測(cè)出蛋白樣品中微量蛋白的含量，檢測(cè)水平已 達(dá)納克級(jí)，而且所需的樣品量少。可以大大降低 檢測(cè)的成本，同時(shí)也提高了檢測(cè)的效率。目前， 蛋白芯片方法逐漸成為免疫分析方法的發(fā)展方向 之一，受到越來(lái)越廣泛地重視。

NaCl、KCl、NA2HPO4 .12H2O、KH2PO4、吐 溫20、乙二胺四乙酸(EDTA)：分析純，南京化學(xué) 試劑有限公司；牛血清白蛋白(BSA)：99%，w/w 美國(guó)默克公司；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；氯霉 素抗體、納米材料標(biāo)記的二抗、銀增強(qiáng)顯色溶液 (A液、B液)：南京祥中生物科技有限公司。 實(shí)驗(yàn)所用水均為18.25 MΩ/cm純凈水(Milli-Q 水凈化系統(tǒng))。10 mmol/L PBS(磷酸鹽緩沖液) pH7.2作為分析緩沖液。洗滌緩沖液PBS含0.05% 吐溫20(PBST)。封閉劑為1% BSA。所有緩沖液在使用前通過(guò)0.22 µm孔徑過(guò)濾器過(guò)濾。生物芯片點(diǎn)樣儀：清華大學(xué)；ELx50自動(dòng)洗板 機(jī)：美國(guó)biotech儀器有限公司；MD-200恒溫振蕩 儀Thermo-shaker、Qarray 2000芯片分析儀、96孔 板芯片載體：南京祥中生物科技有限公司；渦旋 混合器、Lx-100手掌型離心機(jī)：江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；單道可調(diào)移液器：百得 實(shí)驗(yàn)室儀器蘇州有限公司。

稱取10 mg氯霉素和丁 二酸酐溶于1 mL丙酮，振蕩反應(yīng)1.5 h。于40 ℃ 氮吹后，加入200 µL DMSO溶解殘留物，再分別 加入200 µL 5 mg/mL EDC和NHS溶液，振蕩反應(yīng) 2 h。再加入2 mL 5 mg/mL BSA溶液，振蕩反應(yīng)4 h，4 ℃下用1xPBS透析3 d，然后分裝，—20 ℃冷 凍保存?zhèn)溆谩?/span>

陽(yáng)性對(duì)照和制備得到的氯 霉素抗原溶液(CAP-BSA)用生物芯片點(diǎn)樣儀在96 孔板芯片底部制備陣列。共6個(gè)陣列點(diǎn)(2×3陣 列)，每個(gè)陣列點(diǎn)約40 nL，陣列間距約500 µm的 微陣列生物芯片，每個(gè)溶液重復(fù)3個(gè)陣列點(diǎn)。點(diǎn)樣 后，在37 ℃下孵育2 h。為了減少非特異性吸附， 固定后每孔加入200 µL 10 mg/mL BSA，在37 ℃ 封閉1 h。封閉后，生物芯片孔板用1×PBST緩沖 液洗板，拍干，然后用鋁箔袋密封存儲(chǔ)在2～8 ℃ 備用。

本論文采用的 是間接競(jìng)爭(zhēng)微陣列免疫分析原理，見(jiàn)圖1。在微 陣列免疫分析中，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)過(guò)程。每孔中 加入25 µL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再加入已知量的25 µL 混合抗體，25 ℃振蕩反應(yīng)30 min(振蕩速度600 r/ min)。清洗后再加入50 µL AgNPS標(biāo)記的羊抗鼠 IgG，37 ℃振蕩反應(yīng)30 min(振蕩速度600 r/min)。 洗滌后再加入50 µL銀增強(qiáng)顯色溶液(包括溶液A和 溶液B)，在37 ℃中避光反應(yīng)12 min。顯色反應(yīng)結(jié)束后，再清洗3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 氯霉素抗原的紫外表征

氯霉素、BSA都有紫外吸收，但偶聯(lián)后的抗 原，由于共軛體系等的變化，使得其紫外吸收光 譜曲線和λmax都會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變。因此可以用來(lái)鑒定抗原是否偶聯(lián)成功。氯霉素的濃度為0.01 mol/L，BSA的濃度為1 mg/mL，紫外吸收光譜見(jiàn) 圖2。由圖2可知，氯霉素的最大吸收波長(zhǎng)為270 nm，BSA的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，偶聯(lián)后氯霉 素抗原的最大吸收波長(zhǎng)為276 nm，與氯霉素相比 最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，說(shuō)明氯霉素抗原偶聯(lián) 成功。2.2 抗原、抗體和二抗?jié)舛葍?yōu)化 氯霉素抗原、抗體、二抗?jié)舛仁怯绊懜?jìng)爭(zhēng)性 免疫檢測(cè)靈敏度的主要因素，因此檢測(cè)前要對(duì)其 濃度進(jìn)行優(yōu)化。在本文中，氯霉素抗原濃度分 別為1:4，1:8，1:16稀釋；抗體分別為1:80000、 1:160000、1:240000、1:320000稀釋，二抗1:50、 1:100、1:200稀釋。 抗原抗體的濃度低，靈敏度高，但相對(duì)灰度 信號(hào)值(RLUs)也會(huì)降低。綜合兩者，選擇相對(duì)灰 度信號(hào)值在40000左右，確定最佳測(cè)定條件為： 氯霉素抗原最佳濃度為1:8，抗體最佳質(zhì)濃度均為 1:160000，二抗最佳濃度為1:100。

本論文開(kāi)發(fā)的蛋白芯片快速檢測(cè)方法具有操 作簡(jiǎn)單、高通量、快速低成本等特點(diǎn)。氯霉素的 檢出限是0.02 ng/mL，定量限為0.03 ng/mL。本方 法靈敏度高，同時(shí)也不需要復(fù)雜的樣品前處理。 因此，新開(kāi)發(fā)的蛋白芯片方法，具有良好的靈敏 度和簡(jiǎn)單的儀器設(shè)備，同時(shí)具有較低的檢出限和 較好的回收率。利用蛋白芯片法可以快速準(zhǔn)確測(cè) 定蜂蜜中的氯霉素殘留量，具有快速、并行性、 高通量的特點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模樣品的初篩。 在動(dòng)物源性食品殘留抗生素的含量檢測(cè)方面有廣 闊的發(fā)展前景。